Aplicación demicroarrays en el cáncer
El cáncer se puedeconsiderar como una enfermedad genética, producto de una sucesiva acumulaciónde alteraciones genéticas. En un primer momento, para entender la formacióntumoral, se estudiaron genes específicos ó pequeñas regiones cromosómicas a lavez; el problema es que estos métodos de estudio del cáncer son muy lentos yproporcionan una visión muy limitada en los patrones de la expresión genéticaglobal que ocurren en las diferentes fases de formación tumoral. Debido a queestán cientos de genes envueltos simultáneamente en la formación tumoral, esnecesario utilizar tecnologías genómicas de alto rendimiento, como latecnología del ADN microarray, la cual es muy útil en estos casos.
En el ámbito del cáncer,las principales aplicaciones de los microarrays de ADN son la clasificación depolimorfismos de nucleótidos simples (SNP) y de mutaciones, clasificación detumores, identificación de genes-diana supresores de tumores, identificación demarcadores tumorales e identificación de genes que estén relacionados con laquimiorresistencia.
1-Análisis depolimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
Lospolimorfismos de un solo nucleótido procede de la expresión inglesa “SingleNucleotide Polymorphism” (SNP). Se trata de una variación de una sola base de ADNen una secuencia del genoma. Los SNP son la causa más común de variación de lasecuencia de ADN entre los individuos; pudiéndose producir 1 SNP por cada 1000 nucleótidos del genoma humano. Lamayoría de estos SNP no tienen ninguna consecuencia sobre el organismo; sinembargo, alguno de ellos se puede situar en la región codificante de un gen, encuyo caso puede no afectar a la cadena aminoacídica de la proteína (mutaciónsilenciosa) ó afectar a la cadena aminoacídica, lo que puede variar laspropiedades funcionales de la proteína codificada. Los SNP situados fuera delas regiones codificantes también juegan un papel importante, ya que puedenprovocar un splicing erróneo del gen, pueden alterar el promotor del genpotenciándose ó reprimiendo la transcripción del gen ó pueden afectar a otrossitios clave de unión de proteínas al ADN.
Parael análisis de los SNP se utilizan unos microarrays especiales denominados SNPmicroarrays, los cuales contienen alrededor de 400000 secuencias de SNPdiferentes recogidas por el proyecto genoma humano y por el consorcio de SNP.
Existeun gran interés por entender la asociación de estos SNP con la enfermedad, confactores de riesgo ambientales ó con efectos secundarios del tratamiento.Asimismo, descubrir qué papel juega un solo SNP en un fenotipo particular esuna tarea muy difícil, ya que requiere una enorme capacidad de análisis de SNPy un gran número de muestras de ADN que tengan asociadas unos datos clínicos ydemográficos, así como algoritmos para calcular asociaciones multiparamétricas.
Enlos últimos años y tras la secuenciación genómica de una gran multitud deindividuos, se han desarrollado una gran cantidad de aplicaciones de los SNP microarraysen el campo de la investigación oncológica, de los cuales se hablará acontinuación.
1.1-Análisis de LOH
El análisis de las LOH (pérdidas de heterozigosidad) y de los AI (desequilibrios alélicos) fue la primeraaplicación en la que se empleó un SNP microarray en investigacionesoncológicas. Estas investigaciones fueron importantes para la identificación degenes supresores de tumores. El primer estudio lo realizó el equipo deLindblad-Toh en el año 2000, comparando los SNP presentes en el ADN de células de cáncer de pulmón decélulas pequeñas y un control con el ADN normal; como resultado se detectó elmismo patrón de LOH que al realizar el análisis por microsatélites.Posteriormente, en el año 2004, el equipo de Janne demostró que mediante elanálisis de LOH usando un SNP microarray que contenía 1500 SNP de bajadensidad, se puede separar el cáncer de pulmón de células pequeñas de los otroscáncer de pulmón que no sean de células pequeñas.
SNPmicroarray vs. Microsatélites en el análisis de LOH.
Elanálisis por SNP microarray permite detectar múltiples loci polimórficos en unúnico experimento; incluso los microarrays de baja densidad tienen ventajassobre el análisis por microsatélites. En estudios comparando las 2 técnicas seha visto que ambas técnicas muestran los mismos resultados, siendo incluso éstos más exactos con el uso de los SNPmicroarrays. Con la aparición de microarrays de alta densidad, las ventajas delanálisis por esta técnica es mucho mayor. Se pueden detectar cientos de milesde loci simultáneamente, en busca de desequilibrios alélicos, haciendo posibleun rastreo del genoma entero en busca de genes supresores de tumores.
1.2-Análisis de aberraciones en el número de copias en el ADN.
Trashaberse descubierto los SNP microarrays de alta densidad, ha aumentado laresolución genómica; hecho que no se ha logrado con otros microarrays. Desdeeste momento, los SNP microarrays se han utilizado para ver cambios en elnúmero de copias presentes en el genoma de muchos tipos de cáncer.
Secreía que ganancias en el brazo largo del cromosoma 8 se asociaban con un peorpronóstico en el cáncer de próstata; en el año 2004, el grupo de Rubin demostróesto gracias a un ensayo utilizando 15 muestras de cáncer de próstata dediferentes pacientes y, entre otras técnicas, comparó el grado de amplificacióngenética mediante un SNP microarray, el cual contenía 116500 loci de SNP, entrelos que figuraban 60 SNP que se situaban en la zona 8q21, en donde existía unposible oncogén denominado TPD52. A lo largo de la secuencia de este oncogéntambién había repartidos 3 SNP. En los resultados se demostró que existía unaumento del número de copias de esta región, de tal manera que sesobreexpresaba este oncogén.
1.3-Análisis de ligamiento de loci de susceptibilidad al cáncer.
Comolos SNP microarrays pueden analizar los polimorfismos constitucionalespresentes en todo el genoma del individuo, es posible realizar un análisis paraidentificar genes de predisposición al cáncer.
Elequipo de Sellick en el año 2005 descubrió que en la leucemia linfocíticacrónica hay una serie de loci de susceptibilidad: 11p11, 5q22-23, 6p22 y 10q25.Para ello analizó un total de 115 muestras, cada una pertenecía a una familiadiferente, habiendo en cada familia 2 o más casos presentes. Analizó lospolimorfismos empleando un SNP microarray con un total de 11560 SNP diferentes;a continuación realizó un análisis de desequilibrio de ligamiento yposteriormente un análisis de ligamiento con el objetivo de relacionar undeterminado SNP con la susceptibilidad de padecer cáncer.
2-Análisis demutaciones
Los métodos convencionales de detección de mutaciones, como son elSSCP (polimorfismo de conformación de cadena individual de ADN) y el DGGE(electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) tienen muchasdesventajas; se tratan de procedimientos muy largos, los cuales requieren unaelectroforesis en gel y presentan dificultades a la hora de aplicarlas a granescala y a la hora de automatizarlas como aplicación en análisis clínicos enhospitales. El análisis de mutaciones en genes de gran tamaño, como los genesBRCA1 y BRCA2 por los métodos convencionales son especialmente tediosos, lentosy son poco rentables. Es importante desarrollar un método que presente un altorendimiento para identificar posiblesmutaciones rápidamente y con precisión en genes de gran tamaño; estosrequisitos se cumplen con el empleo deDNA microarrays.
En el año 2000, el equipo de Wen realizó un ensayo en el quecomparó la sensibilidad, especificidad y exactitud de la detección demutaciones en el gen TP53 por la técnica SSCP (polimorfismo de conformación decadena individual de ADN) y por un DNA microarray. Se utilizó un DNA microarraycomercial, denominado p53 Genechip, que contenía unas 65000 sondas diferentes ,todas derivadas del gen TP53, en el que cada sonda interrogaba para diferentescambios, como pueden ser cambios en unsolo nucleótido en la secuencia entre los exones 2 y 11 (1262 nucleótidos),delecciones de un solo nucleótido en esta misma secuencia y diferencias de ±2 nucleótidos en el lugardonde se llevó a cabo el splicing. Como muestra para el análisis se emplearon108 carcinomas de ovario los cuáles se analizaron por ambas técnicas en buscade mutaciones y como resultados el DNA microarray era más exacto (94% frente aun 87%) y más sensible (un 92% frente a un 82%) y siendo las dos técnicas igualde específicas.
3-Seguimientode la expresión de genes en los tumores.
3.1-Descubrimiento de nuevos genes y rutasasociadas con la transformación tumoral.
Las proteínas producidas por muchos genes supresoresde tumores y de oncogenes actúan como factores de transcripción, regulando laexpresión génica de otros muchos genes. Utilizando microarrays de ADN se puedenidentificar los genes diana de estos factores de transcripción.
Gen p53
Estegen se trata de un factor de transcripción, que tras su activación induce quese detenga la división celular ó que la célula entre en apoptosis. Mediante unperfil de expresión se puede descubrir a qué genes activa ó reprime sutranscripción cuando esta proteína se activa.
ElEquipo de Zhao, en el año 2000, empleó diferentes líneas celulares dediferentes tipos de cáncer a las cuales sometió a tres tratamientos con agentescarcinogénicos: cloruro de Zinc, radiación UV y radiación γ. Para el ensayo empleó un microarray que contenía sondas para untotal de 6000 genes, descubriéndose que la activación de la proteína p53 induceó reprime la transcripción de genes diferentes, dependiendo del tipo celular ydel agente carcinógeno empleado; habiendo sólo unos pocos genes en común comorespuesta a todos los tratamientos. De los 6000 genes analizados como posiblesdianas de p53, se inducía la expresión de un total de 100 genes, y se reprimíala expresión de unos 54 genes. Todos estos genes participan en fundamentalmenteen la apoptosis, en la detención de la división celular, en genes de proteínas que realizan funciones enel citoesqueleto, factores de crecimiento y sus inhibidores, genes de proteínaspresentes en la matriz extracelular y genes de proteínas de adhesión.
3.2-Descubrimiento de nuevos indicadores dediagnóstico y pronóstico,marcadores de la respuesta terapéutica y mejora de laclasificación de los tumores.
El empleo de microarrays en la clasificación detumores, tiene una enorme importancia a la hora de realizar un diagnóstico y unpronóstico del paciente, ya que hay muchos tipos de tumores que no sediferencian histológicamente, lo que pueden conducir a un falso diagnóstico. Acontinuación se van a describir algunas aplicaciones posibles.
Clasificación de leucemia mieloide aguda y leucemia linfoide aguda.
Diferenciar la leucemia linfoide aguda de la leucemia mieloideaguda es un proceso difícil y complicado, que requiere el empleo de variaspruebas histológicas e inmunológicas; realizar una correcta clasificación deestas leucemias es esencial para administrar al paciente lo antes posible eltratamiento correcto. El equipo del doctor T. R. Golub en el año 1999, diseñóun protocolo para diferenciar estos dos tipos de leucemias en base a unaexpresión diferencial de genes; para ello empleó un Affimetrix Genechip, quecontenía sondas para un total de 6817 genes humanos. Empleó un total de 38muestras, siendo 27 de leucemia linfoide y 11 de leucemia mieloide; como resultadoencontró que existe una expresión diferencial entre estos dos tipos deleucemias en un total de 50 genes. |
Ilustración8 Se muestran las diferencias de expresión génica entre la leucemiamieloide aguda (AML) y la leucemia linfoide aguda (ALL).Nótese en color rojolos genes que se expresan más en cada caso. Cada cuadro en horizontal se tratade una réplica diferente. |
Mejora en la clasificación y en el pronóstico de tumorescerebrales.
Dentrode este grupo se sitúan diferentes tipos de tumores, que se clasifican según sugrado de malignidad. Los de alto grado son los más malignos y tienen un peorpronóstico, dentro de los que cabedestacar el glioblastoma multiforme. Los de bajo grado no son tan malignos ysuelen tener un buen pronóstico, dentro de los que cabe destacar el astrocitomapilocítico.
ElGrupo de David S. Rickman diseñó un ensayo para ver si existía una expresióndiferencial entre los gliomas dediferente grado. Para ello comparó el perfil de expresión genética de unos 45glioblastomas; empleando un Affimetrix Genechip con unos 6800 genes con cadatejido. El estudio descubrió que hay un gran número de genes que presentan unpatrón de expresión diferencial entre gliomas de alto grado y de bajo grado.
4-Identificaciónde los genes implicados en conferir resistencia a tratamientos.
Haymuchos tipos de cáncer en los que se produce una resistencia a lostratamientos. Esta resistencia puede producirse desde que se inicia eltratamiento ó puede haber en un principio una respuesta positiva altratamiento, pero luego se produce una resistencia al tratamiento.
Elgrupo de Kazuya Kudoh, en el año 2000 realizó un experimento en el quedeterminó qué genes están implicados en la resistencia a la doxorubicina encélulas cancerígenas que son resistentes a esta droga. Para ello diseñó unmicroarray sobre una superficie de nylon en el que colocó 3801 sondasdiferentes, cada una de las cuales se correspondía a un gen conocido y 1371sondas de EST. A partir de 2 placas decultivo de esta línea celular, una de ella en estado normal y la otra trasexponerse durante 15 horas a doxorubicina, extrajo el ARNm y lo transformó enADNc. Tras la hibridación, como resultado se observó que hay un grupo de EST yde genes que se sobreexpresan al someter las células a doxorubicina. En esteestudio se demuestra que hay una viabilidad para obtener una huella dactilar del tratamiento delcáncer por el uso de microarrays de ADN.
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Ilustración9 Se muestra cambios en la expresión génica de genes relacionadoscon la resistencia a la doxorubicina (círculos) en una línea celular resistentea doxorubicina en la imagen superior, las células no fueron tratadas con elfármaco; en la imagen inferior, fueron tratadas durante 15 minutos con elfármaco correspondiente. |
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Hola tengo una hija que tiene una alteracion genetica 13q +, no tiene nombre su sindrome ,si le realizo este examen microarrays podre saber algo mas de ella o prevenir Alguna enfermedad asociada a este "sindrome" sin estudio ni nombre
ResponderEliminarHola tengo una hija que tiene una alteracion genetica 13q +, no tiene nombre su sindrome ,si le realizo este examen microarrays podre saber algo mas de ella o prevenir Alguna enfermedad asociada a este "sindrome" sin estudio ni nombre
ResponderEliminarMuy Bueno, me sirvio
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