viernes, 2 de diciembre de 2011

Nociones de Biología: Qué son los microarrays y sus aplicaciones en el cáncer

Introducción
¿Qué es un microarray?
Los microarrays de ADN, también denominados chips de ADN, son una técnica que se emplea para compara la expresión génica diferencial bajo dos condiciones distintas, como puede ser comparar la expresión génica en células normales con células cancerígenas. Se basa en la capacidad de hibridación entre moléculas de ADN complementarias entre sí.
Está formado por una superficie, que puede ser de cristal, sílice ó plástico, la cual posee unas celdas de unos 200 µm de diámetro, en donde se depositan miles de copias de una secuencia nucleotídica, conteniendo cada celda una secuencia diferente y estando éstas perfectamente ordenadas sobre la superficie.
El principio de esta técnica se basa en la capacidad de hibridación entre dos cadenas de ADN complementarias entre sí mediante puentes de hidrógeno. Cuanto menos complementarias sean las secuencias entre sí, éstas se van a unir con una menor afinidad, por lo que tras el lavado sólo permanecen unidas aquellas que son lo más complementarias entre sí; las secuencias parcialmente complementarias se eliminan. La intensidad de señal de una sonda determinada depende de la cantidad de secuencias complementarias presentes en la muestra, que hibridan con la sonda. De esta manera se puede cuantificar de una forma relativa la cantidad de un determinado gen que se expresa en una célula ó en un tejido en función de la intensidad de señal. Al conocerse la situación concreta de cada sonda en un microarray y de qué gen se trata, se puede comparar la expresión de ese gen en diferentes condiciones.
Descubrimiento de los microarrays
Esta técnica está basada en la técnica de biología molecular denominada Southern-blot, en la que en un gel de agarosa se corren fragmentos de ADN, y tras su correcta separación, éstos se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, en donde se efectúa una hibridación con una sonda marcada. En un Southern-blot como máximo sólo se pueden analizar 50 secuencias mientras que en un microarray se pueden analizar hasta 500000 secuencias a la vez.
Esta técnica fue desarrollada por Mark Schena en el año 1995, con élla probó la expresión diferencial de 45 genes de Arabidopsis thaliana, tanto entre plantas mutantes, como entre diferentes órganos de una planta normal. A partir de este año, esta técnica sufrió un gran avance, pudiéndose monitorizar hoy en día miles de genes a la vez. En la actualidad, esta técnica se utiliza principalmente para el estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias condiciones, para la clasificación molecular en enfermedades complejas e identificación de genes característicos de una patología, para la predicción de la respuesta a un tratamiento, y para la detección de mutaciones y de polimorfismos de un único gen. Este trabajo se va a centrar en las aplicaciones de los microarrays de ADN en el estudio del cáncer.
¿Qué es el cáncer?
El Cáncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de células malignas, causado por anormalidades en el material genético de las células, lo que puede ser causado por agentes carcinógenos, como la radiación, productos químicos ó agentes infecciosos; también se puede adquirir durante la replicación normal del ADN, al no corregirse los errores que se producen durante la replicación. Estas mutaciones también pueden ser heredables, por consiguiente la presentan todas las células del organismo. Las principales anormalidades presentes en las células pueden ser mutaciones puntuales, translocaciones, delecciones ó ganancia o pérdida de cromosomas. Los genes más susceptibles de sufrir mutaciones que desencadenen cáncer se denominan proto-oncogenes; cuando éstos están mutados se denominan oncogenes. Normalmente estos genes codifican para factores de crecimiento ó para sus receptores, de manera que una mutación en estos genes puede desencadenar que se sobreexpresen factores de crecimiento ó que su receptor se active en ausencia de ligando, permitiendo a la célula dividirse sin control.

Tipos de microarrays, técnicas de preparación de muestras y análisis de resultados.
A)Tipos de microarrays
1-Spotted microarrays
Fueron los primeros microarrays que se crearon, para ello se utilizan sondas de cDNA, productos de PCR u oligonucleótidos de interés. En estos microarrays se pueden situar hasta 40000 sondas diferentes, correspondiéndose cada una a un gen diferente. Cada una de estas secuencias se sitúa en un pocillo de una placa microtituladora, y a continuación un brazo robótico sitúa una pequeña cantidad (aproximadamente 0,1 nL) de cada sonda en su ubicación predeterminada sobre un portaobjetos recubierto con polilisina, al cual se unen las sondas por una unión inespecífica. Si las sondas son de doble cadena, se pueden desnaturalizar sometiendo el microarray a calor. Ésta se trata de una tecnica comparativa, ya que se pueden emplear para comparar diferencias de expresión génica entre dos tipos celulares, se pueden emplear dos muestras diferentes, cada una marcándola con un fluoróforo diferente, pudiéndose detectar la proporción de la muestra unida en cada celda, viendo la intensidad de fluorescencia que se produce; de ahí que también se le denomine a este tipo matriz de dos muestras.
Ilustración 1 A la izquierda se muestra el proceso de fabricación de un spotted microarray, sobre una placa de vidrio; a la derecha se muestra un esquema de cómoqueda organizado el microarray tras su síntesis, mostrándose al detalle la organización de una celda que contiene sondas para aproximadamente 300 genesdiferentes, viéndose en la parte superior la lectura de una de estas celdas.
Preparación de las muestras para la hibridación:


1-Extracción del ARN de las células, a continuación se aísla el ARNm por medio de diferentes técnicas.
2-Mediante una retrotranscriptasa, con un cebador poli-T y en presencia de aminoalil-dUTP(AA-dUTP); el ARNm se convierte en ADNc.
3-El ADNc de cada muestra se marca con un fluorocromo diferente (Cy3 y Cy5), los cuales se unen al AA-dUTP.
4-Se aplica el ADNc marcado de las dos muestras sobre el microarray, y se deja untiempo determinado para que éste hibride con las sondas.
5-El porta del microarray se lava para eliminar la muestra que no ha hibridado.
6-Se escanea el porta y se analiza la imagen.
2-Affymetrixgene chip technology
Setrata del microarray más comercial y es el más ampliamente utilizado; suconstrucción se produce por síntesis de oligonucleótidos de una longitud de 25nucleótidos, in situ sobre una placa de vidrio; de tal manera que se sintetizanmillones de sondas en un espacio de 1,63 cm2. En la síntesis de losoligos se emplea una fotomáscara, que es similar a la utilizada en laconstrucción de chips semiconductores, que va sintetizando químicamente losoligos, colocando los nucleótidos uno a uno en su posición determinada.
Enun Affimetrix se crean unas 500000 celdas, sintetizándose cientos copias de un mismo oligo en cadacelda.
Adiferencia del spotted microarray, no se utiliza una única sonda por gen; en elaffimetrix, se emplean entre 22 y 40 sondas para un único gen, siendo la mitadde ellas sondas completamente complementarias, denominándose PM (del inglésPerfect Match) y la otra mitad casi completamente complementarias, salvo por unnucleótido que está cambiado en la posición 13, y denominándose MM (del inglésMissMatch). Las sondas que no son completamente complementarias permiten detectar hibridación no específica ehibridación cruzada, hecho que es importante, ya que nos sirve para cuantificarcorrectamente ARN mensajeros que se expresen en baja cantidad. Las celdas PM yMM se sitúan al azar en el chip, evitando que unas estén pegadas a otras. En unAffimetrix se pueden detectar hasta 47700 genes diferentes.
Sólo se puede emplear una muestra por chip, por lo que para comparar dos condiciones distintas, hay que emplear dos chips diferentes.

Ilustración 3 A) representa la estructura microscópica de un genechip. B)Semuestra cómo es un genechip. C) Se muestra cómo se ve el resultado de ungenechip tras su escaneado. D) Pequeño esquema en el que se describe cómo sediseñan las sondas para cada gen en elmicroarray.




Preparación de las muestras para la hibridación
1-Se extrae el ARN de las células, y a continuación se aísla el ARNm por medio de diferentes técnicas.
2-Mediantela una retrotranscriptasa, con un cebador poli-T y en presencia deaminoalil-dUTP (AA-dUTP); el ARNm se convierte en ADNc.
3-Seamplifica el ADNc obtenido anteriormente, usando la ARN polimerasa del fago T7en presencia de UTP y CTP biotinilados; de tal manera, que se obtenían unas50-100 copias de ADNc, en forma de ARNc, marcado con biotina.
4-ElARNc se incuba a 94°C en un tampón defragmentación, para producir fragmentos de ARNc de un tamaño de entre 35 a 200nucleótidos.
5-Seaplica la muestra al chip y se somete a hibridación durante un tiempodeterminado; a continuación se lava el exceso de muestra.
6-Setiñe el ARNc que ha hibridado con el complejo estreptavidina-ficoeritrina; laestreptavidina es una proteína que se une con una alta afinidad a la biotina,mientras que la ficoeritrina se trata de un fluoróforo. Se puede amplificar laseñal añadiendo a continuación IgG anti estreptavidina, los cuales estánbiotinilados, a continuación se vuelve a aplicar el complejoestreptavidina-ficoeritrina.
3-Otros tipos de microarrays
3.1-Microarray digital de microespejos.
Estos microarrays se basan en la síntesis de las sondas en base aun control directo mediante luz. En el año 2003 salió a la venta un kit con elque se podían diseñar y construir los microarrays en el propio laboratorio; eldiseño del microarray se transfiere a una máquina por un ordenador, durando lasíntesis unas 12 horas. Luego se somete a la hibridación y se lava, y unacámara CCD lee los resultados y éstos se transfieren al ordenador. Todos lospasos de esta técnica se realizan en un único instrumento.
3.2-Microarray por inyección
Una compañía adaptó la tecnología de impresión por inyección detinta
desarrollada por HP para la construcción de un microarray sobre unasuperficie de cristal. Existen dos vías posibles para la contrucción de losmicroarrays
:
A)Los oligos de ADNc empleados están presintetizados; luego puedenimprimirse directamente sobre una superficie de cristal; a esta técnica se ledenomina microarray de deposición.
B)Los oligos de ADNc se sintetizan químicamente sobre una fasesólida de fosforamidita en la superficie de cristal. Los nucleótidos que formanlas sondas de van depositando uno a uno.
3.3-Microarray de nanoparticulas
En esta técnica se emplean unas pequeñas cuentas de vidrio, lascuales tienen unidas covalentemente las sondas de oligonucleótidos; las cualesse autoensamblan a su substrato correspondiente. Antes de proceder a lahibridación con la sonda marcada con fluorescente, de sitúa cada cuenta en lamatriz para saber en qué lugar se sitúa cada una de ellas.
3.4-Microarray electrónico
Se trata de una función entre el ADN y los chips; las sondas deADN se colocan por vía electrónica sobre un chip de silicio direccionable. Haydiferentes variedades dependiendo del fabricante, una compañía comercializa unmicroarray en la que la unión de la muestra a la sonda se detecta electrónicamente.Otra compañía comercializa un chip semiconductor direccionable, el cual permiteel control de la síntesis de ADN en cadalugar del chip; en este caso, la unión entre la sonda y la muestra se detectapor fluorescencia.
3.5-Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)
Se trata de una técnica muy atractiva, ya que puede utilizarse enun secuenciador. En el SAGE, los fragmentos de ADNc se denominan tags; éstos seconcatenan por ligamiento y posteriormente son secuenciados. El número de vecesque se secuencia un determinado tag se relaciona con la abundancia de su ARNmcorrespondiente. Por lo tanto, si se secuencia un número suficiente de tagsconcatenados, se puede obtener una medida cuantitativa del pool de ARNmcelular. Cada tag tiene un tamaño de unos 9 a 14 pares de bases; una vezsecuenciado, éste se introduce en una base de datos para ver a qué gen o genesse corresponde. La preparación de la muestra sufre un proceso diferente,también varía un poco el análisis estadístico que sufren los resultados.

B)Procesado de las imágenes obtenidastras la hibridación

Paraprocesar las imágenes existen múltiples herramientas a disposición. En generalse obtiene imágenes de una gran calidad en blanco y negro, en la que cada pixelpuede tener un rango muy amplio de intensidad de señal. Para procesar la imagense llevan a cabo 3 etapas:

1-Localización de cada celda del microarray.

2-Segmentación: consiste en diferenciar los píxeles que son de lacelda de los que son del fondo.

3-Se cuantifica el promedio de las intensidades que forman lacelda.

Ilustración6 Se muestra un programa informático con el que se procesan losresultados obtenidos en el microarray.






C)Análisis estadístico de losresultados

Acontinuación se aplican una serie de pruebas estadísticas, que debido a suenorme complejidad no se van a explicar; pero sí que se enumeran acontinuación:
1-Control de calidad
2-Normalización
3-Diseño experimental
3.1-Fuentes de variabilidad
3.2-Efecto del fluorocromo
4-Clasificación entre genes, entre tumores ó entre proteínas
5-Análisis predictivo de pronóstico ó de tratamiento



Aplicación demicroarrays en el cáncer
El cáncer se puedeconsiderar como una enfermedad genética, producto de una sucesiva acumulaciónde alteraciones genéticas. En un primer momento, para entender la formacióntumoral, se estudiaron genes específicos ó pequeñas regiones cromosómicas a lavez; el problema es que estos métodos de estudio del cáncer son muy lentos yproporcionan una visión muy limitada en los patrones de la expresión genéticaglobal que ocurren en las diferentes fases de formación tumoral. Debido a queestán cientos de genes envueltos simultáneamente en la formación tumoral, esnecesario utilizar tecnologías genómicas de alto rendimiento, como latecnología del ADN microarray, la cual es muy útil en estos casos.
En el ámbito del cáncer,las principales aplicaciones de los microarrays de ADN son la clasificación depolimorfismos de nucleótidos simples (SNP) y de mutaciones, clasificación detumores, identificación de genes-diana supresores de tumores, identificación demarcadores tumorales e identificación de genes que estén relacionados con laquimiorresistencia.

1-Análisis depolimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
Lospolimorfismos de un solo nucleótido procede de la expresión inglesa “SingleNucleotide Polymorphism” (SNP). Se trata de una variación de una sola base de ADNen una secuencia del genoma. Los SNP son la causa más común de variación de lasecuencia de ADN entre los individuos; pudiéndose producir 1 SNP por cada 1000 nucleótidos del genoma humano.
Lamayoría de estos SNP no tienen ninguna consecuencia sobre el organismo; sinembargo, alguno de ellos se puede situar en la región codificante de un gen, encuyo caso puede no afectar a la cadena aminoacídica de la proteína (mutaciónsilenciosa) ó afectar a la cadena aminoacídica, lo que puede variar laspropiedades funcionales de la proteína codificada. Los SNP situados fuera delas regiones codificantes también juegan un papel importante, ya que puedenprovocar un splicing erróneo del gen, pueden alterar el promotor del genpotenciándose ó reprimiendo la transcripción del gen ó pueden afectar a otrossitios clave de unión de proteínas al ADN.
Parael análisis de los SNP se utilizan unos microarrays especiales denominados SNPmicroarrays, los cuales contienen alrededor de 400000 secuencias de SNPdiferentes recogidas por el proyecto genoma humano y por el consorcio de SNP.
Existeun gran interés por entender la asociación de estos SNP con la enfermedad, confactores de riesgo ambientales ó con efectos secundarios del tratamiento.Asimismo, descubrir qué papel juega un solo SNP en un fenotipo particular esuna tarea muy difícil, ya que requiere una enorme capacidad de análisis de SNPy un gran número de muestras de ADN que tengan asociadas unos datos clínicos ydemográficos, así como algoritmos para calcular asociaciones multiparamétricas.
Enlos últimos años y tras la secuenciación genómica de una gran multitud deindividuos, se han desarrollado una gran cantidad de aplicaciones de los SNP microarraysen el campo de la investigación oncológica, de los cuales se hablará acontinuación.

1.1-Análisis de LOH
El análisis de las LOH (pérdidas de heterozigosidad) y de los AI (desequilibrios alélicos) fue la primeraaplicación en la que se empleó un SNP microarray en investigacionesoncológicas. Estas investigaciones fueron importantes para la identificación degenes supresores de tumores. El primer estudio lo realizó el equipo deLindblad-Toh en el año 2000, comparando los SNP presentes en el ADN de células de cáncer de pulmón decélulas pequeñas y un control con el ADN normal; como resultado se detectó elmismo patrón de LOH que al realizar el análisis por microsatélites.Posteriormente, en el año 2004, el equipo de Janne demostró que mediante elanálisis de LOH usando un SNP microarray que contenía 1500 SNP de bajadensidad, se puede separar el cáncer de pulmón de células pequeñas de los otroscáncer de pulmón que no sean de células pequeñas.

SNPmicroarray vs. Microsatélites en el análisis de LOH.
Elanálisis por SNP microarray permite detectar múltiples loci polimórficos en unúnico experimento; incluso los microarrays de baja densidad tienen ventajassobre el análisis por microsatélites. En estudios comparando las 2 técnicas seha visto que ambas técnicas muestran los mismos resultados, siendo incluso éstos más exactos con el uso de los SNPmicroarrays. Con la aparición de microarrays de alta densidad, las ventajas delanálisis por esta técnica es mucho mayor. Se pueden detectar cientos de milesde loci simultáneamente, en busca de desequilibrios alélicos, haciendo posibleun rastreo del genoma entero en busca de genes supresores de tumores.

1.2-Análisis de aberraciones en el número de copias en el ADN.
Trashaberse descubierto los SNP microarrays de alta densidad, ha aumentado laresolución genómica; hecho que no se ha logrado con otros microarrays. Desdeeste momento, los SNP microarrays se han utilizado para ver cambios en elnúmero de copias presentes en el genoma de muchos tipos de cáncer.
Secreía que ganancias en el brazo largo del cromosoma 8 se asociaban con un peorpronóstico en el cáncer de próstata; en el año 2004, el grupo de Rubin demostróesto gracias a un ensayo utilizando 15 muestras de cáncer de próstata dediferentes pacientes y, entre otras técnicas, comparó el grado de amplificacióngenética mediante un SNP microarray, el cual contenía 116500 loci de SNP, entrelos que figuraban 60 SNP que se situaban en la zona 8q21, en donde existía unposible oncogén denominado TPD52. A lo largo de la secuencia de este oncogéntambién había repartidos 3 SNP. En los resultados se demostró que existía unaumento del número de copias de esta región, de tal manera que sesobreexpresaba este oncogén.

1.3-Análisis de ligamiento de loci de susceptibilidad al cáncer.
Comolos SNP microarrays pueden analizar los polimorfismos constitucionalespresentes en todo el genoma del individuo, es posible realizar un análisis paraidentificar genes de predisposición al cáncer.
Elequipo de Sellick en el año 2005 descubrió que en la leucemia linfocíticacrónica hay una serie de loci de susceptibilidad: 11p11, 5q22-23, 6p22 y 10q25.Para ello analizó un total de 115 muestras, cada una pertenecía a una familiadiferente, habiendo en cada familia 2 o más casos presentes. Analizó lospolimorfismos empleando un SNP microarray con un total de 11560 SNP diferentes;a continuación realizó un análisis de desequilibrio de ligamiento yposteriormente un análisis de ligamiento con el objetivo de relacionar undeterminado SNP con la susceptibilidad de padecer cáncer.

2-Análisis demutaciones
Los métodos convencionales de detección de mutaciones, como son elSSCP (polimorfismo de conformación de cadena individual de ADN) y el DGGE(electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) tienen muchasdesventajas; se tratan de procedimientos muy largos, los cuales requieren unaelectroforesis en gel y presentan dificultades a la hora de aplicarlas a granescala y a la hora de automatizarlas como aplicación en análisis clínicos enhospitales. El análisis de mutaciones en genes de gran tamaño, como los genesBRCA1 y BRCA2 por los métodos convencionales son especialmente tediosos, lentosy son poco rentables. Es importante desarrollar un método que presente un altorendimiento para identificar posiblesmutaciones rápidamente y con precisión en genes de gran tamaño; estosrequisitos se cumplen con el empleo deDNA microarrays.
En el año 2000, el equipo de Wen realizó un ensayo en el quecomparó la sensibilidad, especificidad y exactitud de la detección demutaciones en el gen TP53 por la técnica SSCP (polimorfismo de conformación decadena individual de ADN) y por un DNA microarray. Se utilizó un DNA microarraycomercial, denominado p53 Genechip, que contenía unas 65000 sondas diferentes ,todas derivadas del gen TP53, en el que cada sonda interrogaba para diferentescambios, como pueden ser cambios en unsolo nucleótido en la secuencia entre los exones 2 y 11 (1262 nucleótidos),delecciones de un solo nucleótido en esta misma secuencia y diferencias de ±2 nucleótidos en el lugardonde se llevó a cabo el splicing. Como muestra para el análisis se emplearon108 carcinomas de ovario los cuáles se analizaron por ambas técnicas en buscade mutaciones y como resultados el DNA microarray era más exacto (94% frente aun 87%) y más sensible (un 92% frente a un 82%) y siendo las dos técnicas igualde específicas.

3-Seguimientode la expresión de genes en los tumores.

3.1-Descubrimiento de nuevos genes y rutasasociadas con la transformación tumoral.
Las proteínas producidas por muchos genes supresoresde tumores y de oncogenes actúan como factores de transcripción, regulando laexpresión génica de otros muchos genes. Utilizando microarrays de ADN se puedenidentificar los genes diana de estos factores de transcripción.

Gen p53
Estegen se trata de un factor de transcripción, que tras su activación induce quese detenga la división celular ó que la célula entre en apoptosis. Mediante unperfil de expresión se puede descubrir a qué genes activa ó reprime sutranscripción cuando esta proteína se activa.
ElEquipo de Zhao, en el año 2000, empleó diferentes líneas celulares dediferentes tipos de cáncer a las cuales sometió a tres tratamientos con agentescarcinogénicos: cloruro de Zinc, radiación UV y radiación γ. Para el ensayo empleó un microarray que contenía sondas para untotal de 6000 genes, descubriéndose que la activación de la proteína p53 induceó reprime la transcripción de genes diferentes, dependiendo del tipo celular ydel agente carcinógeno empleado; habiendo sólo unos pocos genes en común comorespuesta a todos los tratamientos. De los 6000 genes analizados como posiblesdianas de p53, se inducía la expresión de un total de 100 genes, y se reprimíala expresión de unos 54 genes. Todos estos genes participan en fundamentalmenteen la apoptosis, en la detención de la división celular, en genes de proteínas que realizan funciones enel citoesqueleto, factores de crecimiento y sus inhibidores, genes de proteínaspresentes en la matriz extracelular y genes de proteínas de adhesión.

3.2-Descubrimiento de nuevos indicadores dediagnóstico y pronóstico,marcadores de la respuesta terapéutica y mejora de laclasificación de los tumores.
El empleo de microarrays en la clasificación detumores, tiene una enorme importancia a la hora de realizar un diagnóstico y unpronóstico del paciente, ya que hay muchos tipos de tumores que no sediferencian histológicamente, lo que pueden conducir a un falso diagnóstico. Acontinuación se van a describir algunas aplicaciones posibles.

Clasificación de leucemia mieloide aguda y leucemia linfoide aguda.
Diferenciar la leucemia linfoide aguda de la leucemia mieloideaguda es un proceso difícil y complicado, que requiere el empleo de variaspruebas histológicas e inmunológicas; realizar una correcta clasificación deestas leucemias es esencial para administrar al paciente lo antes posible eltratamiento correcto. El equipo del doctor T. R. Golub en el año 1999, diseñóun protocolo para diferenciar estos dos tipos de leucemias en base a unaexpresión diferencial de genes; para ello empleó un Affimetrix Genechip, quecontenía sondas para un total de 6817 genes humanos. Empleó un total de 38muestras, siendo 27 de leucemia linfoide y 11 de leucemia mieloide; como resultadoencontró que existe una expresión diferencial entre estos dos tipos deleucemias en un total de 50 genes.

Ilustración8 Se muestran las diferencias de expresión génica entre la leucemiamieloide aguda (AML) y la leucemia linfoide aguda (ALL).Nótese en color rojolos genes que se expresan más en cada caso. Cada cuadro en horizontal se tratade una réplica diferente.

Mejora en la clasificación y en el pronóstico de tumorescerebrales.
Dentrode este grupo se sitúan diferentes tipos de tumores, que se clasifican según sugrado de malignidad. Los de alto grado son los más malignos y tienen un peorpronóstico, dentro de los que cabedestacar el glioblastoma multiforme. Los de bajo grado no son tan malignos ysuelen tener un buen pronóstico, dentro de los que cabe destacar el astrocitomapilocítico.
ElGrupo de David S. Rickman diseñó un ensayo para ver si existía una expresióndiferencial entre los gliomas dediferente grado. Para ello comparó el perfil de expresión genética de unos 45glioblastomas; empleando un Affimetrix Genechip con unos 6800 genes con cadatejido. El estudio descubrió que hay un gran número de genes que presentan unpatrón de expresión diferencial entre gliomas de alto grado y de bajo grado.

4-Identificaciónde los genes implicados en conferir resistencia a tratamientos.
Haymuchos tipos de cáncer en los que se produce una resistencia a lostratamientos. Esta resistencia puede producirse desde que se inicia eltratamiento ó puede haber en un principio una respuesta positiva altratamiento, pero luego se produce una resistencia al tratamiento.
Elgrupo de Kazuya Kudoh, en el año 2000 realizó un experimento en el quedeterminó qué genes están implicados en la resistencia a la doxorubicina encélulas cancerígenas que son resistentes a esta droga. Para ello diseñó unmicroarray sobre una superficie de nylon en el que colocó 3801 sondasdiferentes, cada una de las cuales se correspondía a un gen conocido y 1371sondas de EST. A partir de 2 placas decultivo de esta línea celular, una de ella en estado normal y la otra trasexponerse durante 15 horas a doxorubicina, extrajo el ARNm y lo transformó enADNc. Tras la hibridación, como resultado se observó que hay un grupo de EST yde genes que se sobreexpresan al someter las células a doxorubicina. En esteestudio se demuestra que hay una viabilidad para obtener una huella dactilar del tratamiento delcáncer por el uso de microarrays de ADN.



Ilustración9 Se muestra cambios en la expresión génica de genes relacionadoscon la resistencia a la doxorubicina (círculos) en una línea celular resistentea doxorubicina en la imagen superior, las células no fueron tratadas con elfármaco; en la imagen inferior, fueron tratadas durante 15 minutos con elfármaco correspondiente.

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